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双色球基本走势图100期:漲知識!你不知道的WB問答!

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蛋白質印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot,是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。結合化學發光檢測,可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。


原理如下圖:





但是該技術卻非常依賴經驗的積累,為了給廣大實驗同仁們提供有意義的參考和經驗,小編將提供解決實驗過程中遇到問題的一些辦法,僅供參考。


電泳轉印不成功?




1、轉印時間過短


2、電源條件不適當


轉印開始前核實電流;更換緩沖液或增加電壓設定值;嘗試高電場強度轉??;核實電源最高的電流值。


3、蛋白轉印穿透印跡膜


如果印跡膜功率條件設定太高或轉印時間過長,蛋白會穿過膜并轉印到濾紙上。


4、蛋白轉印方向相反


凝膠/印跡膜三明治結構組裝順序相反或放入相反的電極板間;核實電源線的電極是否接反。


5、檢測系統失靈或靈敏度太低


加入適當的陰、陽性抗原對照試劑以檢測試劑盒的靈敏度。


6、錯誤的電荷質量比


使用更酸或更堿性的緩沖液增加轉印效率;蛋白在它們的等電點附近不能全部轉?。ɑ撼逡旱腜H值應該比靶蛋白的等電點低或高2個PH值)


7、蛋白在凝膠中沉淀


在緩沖液加入少量的SDS;消除或降低轉印緩沖液中乙醇的含量


8、緩沖液中的甲醇抑制蛋白洗脫


降低甲醇的含量,通常使用量為20%


9、電源線路故障或電源使用不當


檢查保險絲,檢查電源輸出功率


10、凝膠濃度過高


降低%T(全單體)或%C(交聯體)。使用5%C(甲叉丙烯酰胺交聯劑),可使凝膠孔徑最小。降低凝膠孔徑最小。降低凝膠濃度,增大孔徑,可以提高轉印效率



蛋白印記免疫檢測出現高背景




1、封閉不完全


2、清洗不充分


增加清洗次數、時間以及清洗劑的去污力。


在抗體緩沖液中加入Tween-20會降低非特異結合。


3、印跡膜在底物溶液中放置時間過長


4、電泳或轉印過程中污染


5、凝膠上的蛋白樣品過載或在轉印緩沖液中使用了過多的SDS,蛋白直接穿透印跡膜并在轉印體系中循環而不能結合在印跡膜上


6、一級或二級抗體濃度過高


7、溫育槽被污染


清洗溫育槽或使用一次性溫育槽


中洪WB實驗流程:


①做膠:先制成分離膠和壓縮膠。


②上樣:先做好制膠器平板,先后加入已制成的分離膠和壓縮膠(需要大概十幾分鐘反應十幾,與溫度相關,成反比),之后加梳子(有孔,方便后期加入蛋白)加入蛋白。


③跑電泳:需要三個小時。


④轉膜:把PVDF膜貼在膠上。


⑤封閉:封閉不需要的蛋白。


⑥一抗孵育:用的抗體是特定的,放在搖床上,時間需要一上午。


⑦洗膜:把多余的抗體洗掉,洗三次,每次十分鐘。


⑧二抗孵育:抗體是通用的,只要來源相同即可。


⑨再次洗膜:把多余的抗體洗掉,洗三次,每次十分鐘。


⑩曝光:放在成像儀上面成像。(條帶清晰,直,無氣泡,結果就是好的)


中洪WB實驗操作與結果案例圖







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