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双色球基本走势图50期:質粒轉化不用愁

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分子克隆實驗中還有有關質粒的問題是實驗研究的必備技能之一。今天中洪君與大家就好好說道說道質粒的轉化——


質粒轉化原理


質粒的轉化是指將質?;蛞運靨騫菇ǖ鬧刈樽擁既胂婦墓?。將連接產物轉化到感受態細胞中,實現重組克隆的增殖,便于后續分子操作??梢圓捎枚嘀址椒ㄉ稈『圖康目寺?。實驗目的是掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態細胞及轉化子的鑒定方法。


質粒常規轉化實驗方法與步驟


1、取一個1.5ml離心管,加入50μl感受態細胞懸液,置冰上。加入50-100ug質粒,用移液器輕柔混勻。冰上靜置20min。


2、將EP管先放于42℃水浴中熱激30-40秒,然后迅速置冰上3~5min。整個過程不要振蕩菌液。


3、加入500ul LB液體培養基(一定不含抗生素),混勻后37℃振蕩培養(180rpm)1小時,使細菌恢復正常生長狀態,并表達質粒編碼的抗生素抗性基因。


4、制備含有Amp抗生素的LB平板。


5、取100ul菌液,將液體滴加至含有抗生素Amp的LB固體培養基平板上,用三角玻璃棒均勻涂抹。


6、37℃培養箱內正置15分鐘, 待菌液被培養基吸收后,37℃倒置培養12~16小時,次日可見均勻分布的陽性克隆。挑取單克隆菌落后,送公司測序,驗證是否為陽性篩選質粒?;蛘咧苯猶羧【浜?,加至含有抗生素的液體LB肉湯中搖菌,獲得大量菌液后提取質粒。


目前市面上也有一些快速轉化感受態細胞。轉化過程不需要冰浴、熱敷和孵育等步驟,比如有些感受態細胞實現了五分鐘轉化:


1.  取一個1.5ml離心管,加入50μl感受態細胞懸液,置冰上2分鐘。


2.  42度熱激30s。


3.  置冰上2分鐘。


4.  加入200ulLB液體培養基后,均勻涂抹于37度預熱的抗生素LB固體平板。注意,此時LB固體平板一定要先放于37度培養箱中預熱。



注意事項:


1. 感受態可用滅菌的離心管分裝使用。


      2. 根據需要在第5步驟時將轉化液6000rpm離心3min,然后只留下100μl左右的上清液,混勻沉淀,全部加入相對應的平板中。


3. 轉化過程在超凈工作臺中進行。


轉化失敗案例解答:


Q:我們做了轉化,1ul的質粒加入4ulM水,取1.5ul進入感受態細胞,1mlLB培養基,涂了2個板子,結果沒長一個菌,應該是能長出來了,步驟的話就是加入感受態后冰浴30min多冰了5min,熱激后冰浴5min又多冰了3、4min,然后就沒有什么地方出錯了,質粒是別的實驗室寄過來的,好的。不知道啥原因,請教下轉化失敗的可能原因有哪些?


這一批感受態還不錯,有人做了別的挺好,熱激很注意的,沒問題,是熱激后迅速冷卻那兒冰久了點 ,無抗的LB復蘇了50min,糾結啊~


      A:質粒轉化一般是沒啥問題的。但是結果你杯具了。


我總結幾個原因:


1.熱擊標準時間是60-90s,你注意下你是不是熱擊超時;


2.感受態細胞的問題,感受態是否保存時間過長效率降低;同時,感受態最高的轉化效率在解凍的短時間內。你要注意你是否沒有在解凍的短時間內加入需轉化質粒;


3.質??剮栽?,要搞清楚你的質粒是什么抗性,是amp還是kana?涂錯了板子你就徹底杯具了;


4.有的感受態不是很猛,你轉化進去的質粒不能很快使細菌表現出抗性。你迅速涂板子,你就杯具了。有時候要用無抗的LB培養基復蘇一下細菌,一般30-60min。


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