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双色球基本走势图体坛网:輕松搞定microRNA靶基因驗證

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當前,microRNA對靶基因的功能研究十分熱門。利用熒光素酶報告基因檢測實驗尋找或驗證microRNA對靶點作用性是不可或缺的實驗技術。中洪博元可為您提供microRNA報告基因載體構建服務,并可進一步為您提供熒光素酶報告基因檢測實驗服務。


您只需要提供目的microRNA靶位點序列,我們專業的技術服務人員就可替您完成載體構建,為您節省大量的時間和精力。(服務內容包括:靶位點序列合成、載體構建、細胞轉染、熒光信號檢測和結果分析。


下圖為雙熒光素酶報告基因載體表達框架示意圖,具有多克隆位點,方便插入目的靶點序列。pmirGLO載體包含螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶報告基因。


螢火蟲熒光素酶報告基因為主要報告基因。若目的基因表達被抑制,則使螢火蟲熒光素酶轉錄過程受阻,抑制螢火蟲熒光素酶蛋白翻譯,螢火蟲熒光值下降,而作為標準化內參照的海腎熒光素酶的表達不受影響,此時螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性值下降,從而可以確定miRNA與靶基因是否具有直接調控作用。



圖片來源:中洪博元醫學實驗幫


構建雙熒光素酶報告基因實驗流程:


構建含靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體、microRNA mimics或 microRNA negativecontrol共轉染293T或Hela細胞。共轉染細胞24-72h后,進行雙熒光素酶檢測,進一步驗確定目的 microRNA的靶基因。


1. microRNA靶點的預測


利用Targetscan,miRDB,PicTar軟件預測靶基因3’UTR與microRNA的結合位點。


2. 構建含靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體


根據軟件預測的靶基因3’UTR與microRNA的結合位點,設計引物PCR擴增靶基因3’UTR序列,或直接進行基因合成,再插入到雙熒光素酶報告基因載體上。


3.microRNA mimics和 microRNA negativecontrol的合成


      合成相應的microRNA mimics和 microRNA negativecontrol.


      4.細胞轉染準備


      將靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體和microRNA mimics或microRNA negativecontrol共轉染293T或Hela細胞。


      5.熒光素酶檢測


      共轉染細胞24-72h后,進行雙熒光素酶檢測,確定目的microRNA的靶基因。


整理分析數據,得出結論:


      提供有含靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體甘油保存菌株一支,microRNA mimics和 microRNA negativecontrol各一只。


附相應的載體的說明書以及實驗報告:


包括載體構建過程,載體鑒定記錄,測序報告,細胞轉染,熒光檢測,圖表輸出和結果分析。

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