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双色球基本走势图2元:免疫熒光細胞化學染色方法

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一、標本制作

   可制作涂片、印片、細胞單層培養物、組織切片,經適當固定或不固定,作免疫熒光染色用。


二、熒光抗體染色方法

(一)直接法

1.染色 切片經固定后,滴加經稀釋至染色效價如1:8或1:16的熒光抗體(如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等),在室溫或37℃染色30min,切片置入能保持潮濕的染色盒內,防止干燥。

2.洗片  傾去存留的熒光抗體,將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次,攪拌,每次5min,再用蒸餾水洗1min,除去鹽結晶。

3.用50%緩沖(0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0~9.5)甘油封固、鏡檢

4.對照染色

①正常免熒光血清染色,如上法處理切片,結果應為陰性。②染色抑制試驗(一步法):將熒光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法處理切片。結果應為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致,可用鹽水代替未標記抗血清,染色結果應為陽性。此法結果較二步法穩定。③類屬抗原染色試驗,前面已作敘述。

直接法比較簡單,適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應的抗原,特異性高而敏感性較低。


(二)間接法

(1)切片固定后用毛細滴管吸取經適當稀釋的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的濕度,37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液體。

(2)再滴加間接熒光抗體(如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等),同上步驟,染色30min,37℃,緩沖鹽水洗兩次10min,攪拌,緩沖甘油封固,鏡檢。

對照染色:①抗體對照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法進行染色,結果應為陰性。②抗原對照:即類屬抗原染色,亦應為陰性。③陽性對照。

間接法中上述方法稱雙層法(Double Layer Method)。另一種稱夾心法,即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合,再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上,而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在,方法步驟如下:

①切片或涂片固定后,置于染色濕盒內。

②滴加未標記的特異性抗原作用切片于37℃,30min。

③緩沖鹽水洗2次,每次5min,吹干。

④滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃,30min。

⑤如③水洗。

⑥緩沖甘油封固,鏡檢。

間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原,敏感性較高,操作方法較易掌握,而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體(如麻疹)等的研究和檢查,所以已被廣泛應用于自身抗體和感染病人血清的試驗。


(三)補體法

1.材料

(1)免疫血清60℃滅活20min,用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1:2,1:4,1:8……。補體用1:10稀釋的新鮮豚鼠血清,抗補體熒光抗體等,按下述的補體法染色。免疫血清補體結合的效價,如為1:32則免疫血清應作1:8稀釋。

(2)補體用新鮮豚鼠血清一般作1:10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果,按2單位的比例,用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中,溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

(3)抗補體熒光抗體:在免疫血清效價為1:4,補體為2單位的條件下,用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價,然后按染色效價1:4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。


2.方法步驟

(1)涂片或切片固定。

(2)吸取經適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液(此時免疫血清及補體又都稀釋一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定濕度的染色盒內。

(3)用緩沖鹽水洗2次,攪拌,每次5min,吸干標本周圍水液。

(4)滴加經過適當稀釋之抗補體熒光抗體30min,37℃,水洗同(3)。

(5)蒸餾水洗1min,緩沖甘油封固。


3.對照染色

(1)抗原對照。

(2)抗血清對照:用正常兔血清代替免疫血清。

(3)滅活補體對照:將補體經56℃30min處理后,按補體同樣比例稀釋,與免疫血清等量混合后,進行補體法染色。

本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制,因而一種熒光抗體可作更廣泛的應用,敏感性亦較間接法高,效價低的免疫血清亦可應用,節 省免疫血清,尤其是對檢查形態小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質時甚為理想。


(四)膜抗原熒光抗體染色法

本法應用直接法或間接法的原理和步驟,可對活細胞在試管內進行染色,常用于T和B細胞、細胞培養物、瘤細胞抗原和受體等的檢查和研究,陽性熒光主要在細胞膜上。FACS即采用此法原理。


(五)雙重染色法

在同一標本上有兩個抗原需要同時顯示(如A抗原和B抗原),A抗原的抗體用FITC標記,B抗原的抗體用羅達明標記,可采用以下染色方法:

1.一步法雙染色  先將兩種標記抗體按適當比例混合(A+B),按直接法進行染色。

2.二步法雙染色 先用RB200標記的B抗體染色,不必洗去,再用FITC標記的A抗體染色,按間接法進行。

結果:A抗原陽性熒光呈現綠色,B抗原陽性呈現桔紅色熒光。


(六)熒光抗體再染色法

若切片或其他標本經某種熒光抗體染色后,未獲得陽性結果,而又疑有另外的病原體存在時,可用相應的熒光抗體再染色。

有時存檔蠟塊不能再用以切片,也可用存檔的HE染色標本,褪去蓋片和顏色,再作免疫熒光或其它免疫細胞化學的染色。


三、熒光抗原染色法

  某些抗原可以用熒光素標記,制成熒光抗原,標記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細胞或組織內的相應抗體,特異性較好,敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法。由于多數抗原難以提純或量少不昂貴,一般很少采用此法。

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