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双色球基本走势图体坛网9188体坛周报:免疫熒光雙標實驗,哪一步最容易出錯

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免疫熒光實驗作為最常見的實驗之一,應用化學方法將熒光色素(主要是異硫氰酸熒光黃,fluorescein isoth iocyanate,FITC)與抗體結合起來,即熒光抗體,這種結合熒光色素的抗體的免疫原性并不因此而發生改變。


實驗原理:


在特定條件下用其著染標本,如果標本中存在有相應的抗原,熒光抗體便與標本中的抗原發生特異性結合,在熒光顯微鏡的藍紫光或紫外光照射下,標本中的抗原抗體復合物便發出特異的熒光,熒光的出現表明被檢標本中特異抗原的存在;如果標本中不存在相應抗原,兩者便不能結合,水洗時,熒光抗體便被洗掉,因而標本在熒光顯微鏡下觀察不呈現特異熒光。因此,可以根據熒光的有無及強弱來判定抗原與抗體是否存在或相對應。


那么常用的免疫熒光雙標的實驗過程是怎么樣的呢,小編就帶著大家簡單的復習一下!


(1)直接法雙重免疫熒光標記:


將標記有兩種不同熒光素的抗體(如抗A和抗B)以適當比例混合,滴加在標本上孵育,然后洗去未結合的熒光抗體,在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發濾片觀察,即可對兩種抗原進行定位和定量。直接法簡便可靠,但靈敏度較低。


(2)間接法雙重免疫熒光標記:


用未標記的兩種特異性第一抗體孵育組織或細胞,洗去多余的第一抗體后,再用兩種不同的熒光素分別標記的第二抗體孵育組織或細胞,洗去多余的第二抗體,后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發濾片觀察,從而對兩種抗原進行定位和定量。使用此法應注意兩種特異性第一抗體必須來源于不同種屬,且熒光標記第二抗體的種屬必須與第一抗體的種屬相匹配。


實驗注意事項: 


1、熒光染色后一般在1h內完成觀察,或于4℃保存4h,時間過長,可能會使熒光提前衰退。


2、每次試驗均需設置以下三種對照:


(1) 陽性對照:陽性血清+熒光標記物;


(2) 陰性對照:陰性血清+熒光標記物;


(3) 熒光標記物對照:PBS+熒光標記物。



1、合適的細胞密度


細胞密度是試驗成功的第一步,細胞密度太大,會造成細胞過于擁擠而邊界不清晰,不僅細胞形態不佳且易導致染色背景深。同理細胞過少時不僅容易貼壁不好觀察時不好找細胞,而且由于細胞過少可能活性不佳從而易發生非特異性熒光染色。不管是用六孔板還是共聚焦皿細胞密度以達到75%-85%最佳。


2、細胞固定和通透


固定劑的選擇依賴于抗原的亞細胞定位(膜蛋白,可溶,細胞骨架相關蛋白等)。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定劑,適用于絕大多數蛋白。如果是研究膜蛋白的話,最好用3.7%-4%的甲醛。而研究細胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步驟,通透即是在膜上打孔,讓抗體更易進入細胞與抗原結合。


選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X 100,而選擇甲醇固定一般無需再通透,甲醇本身就有通透的作用。


3、封閉條件的優化選擇


為了防止內源性非特異性蛋白抗原的結合,需要在一抗孵育前用封閉液封閉,這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清,一般來說,血清價格比較昂貴,可以用1%-5%BSA替代,BSA可以說是萬能的封閉血清。另外封閉時間不易過長,30-60min即可,且封閉后不用洗滌,直接加一抗孵育即可。


4、一抗二抗的選擇


封閉過后需要一抗孵育,可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h,以筆者的經驗是一抗孵育4度過夜比較好,抗原抗體結合會比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據抗體說明書來,再根據自己具體的實驗要求進行優化。如果抗體濃度過低,會造成信號太弱,如果抗體濃度過高可能會造成背景染色太強。熒光二抗個人感覺Alex flour熒光基團信號強于Dylight強于FITC。如果做免疫雙標,一抗要來自不同種屬,熒光二抗的光譜也要分開。


5、洗滌步驟


免疫熒光過程中,有很多洗滌步驟,用PBS即可。在洗滌過程中,一要注意動作輕柔,固定后的細胞比較脆弱,如果太過大力,很容易把細胞吹洗掉,二是洗滌時間要把握好,每次洗滌5min左右,三是切忌不要干片,即吸掉溶液后不要把細胞干著,不然容易造成背景著色。



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